脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法的經(jīng)驗分享

 　　脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法的經(jīng)驗分享：

　　1、轉(zhuǎn)染前1天將0.5～2×105細胞接種于24孔培養(yǎng)板，并加入500ul不含抗生素的*培養(yǎng)基，以保證轉(zhuǎn)染時細胞匯合達90～95%。

　　2、準備復(fù)合物

　　(1) 將0.8ug DNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。

　　(2) 將2ul Lipofectamine2000稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中，輕輕渾勻，室溫孵育5分。注意：必須在25分內(nèi)進行。

　　(3) 5分后將它們混合，并輕輕渾勻，室溫孵育20分。

　　3、吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，用PBS或無血清培養(yǎng)基()清洗細胞2次。

　　4、將復(fù)合物(總體積100ul)加入培養(yǎng)孔，前后搖動培養(yǎng)板使其分布均勻。

　　5、將細胞放入培養(yǎng)箱孵育4～6h后，可以更換含血清培養(yǎng)液去除復(fù)合物(也可不用)。

　　6、24～48h后可以觀察轉(zhuǎn)入基因表達情況。

　　7、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：換含血清培養(yǎng)基24h后將細胞以1：10(或更高比例)傳代，1天后更換篩選培養(yǎng)基篩選。

　　8、優(yōu)化：要保證細胞匯合率達90～95%(比較高);DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.5～1：5，一般細胞1：2～3.

　　脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法的主要優(yōu)點是可用將DNA轉(zhuǎn)染至懸浮或者鐵壁細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率相對較高、對基因片段大小的限制較小等，但是

　　陽離子脂質(zhì)體2000對細胞的毒性相對較高，為了防止其毒性，要摸索好如下實驗條件：脂質(zhì)體2000與質(zhì)粒的比例、細胞轉(zhuǎn)染時間等。