看完本篇你就知道在使用超濾管時的注意事項了

　　超濾管通常用于蛋白質(zhì)濃縮和緩沖液置換。還有其他型號，它們具有不同的體積大小和超濾管，這取決于目標(biāo)蛋白質(zhì)的分子量，濃縮前的體積和濃縮的目標(biāo)體積，可重用的。
 

　　下面讓我們一起來了解一下超濾管的使用方法吧。
 

　　1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃度體積。通常，分子量應(yīng)不大于靶蛋白分子量的1/3。如果目標(biāo)蛋白的分子量約為10kD，則可以使用截留分子量為3kD的超濾管。
 

　　2、新購買的超濾是干燥的。使用前添加MilliQ水。水量*通過膜，并在冰浴或冰箱中預(yù)冷幾分鐘。然后倒出水以添加蛋白質(zhì)溶液。蛋白質(zhì)溶液的量不得超過試管頂部的白線。操作輕巧。在添加蛋白質(zhì)溶液之前，需要將超濾管插入冰中進(jìn)行預(yù)冷卻。
 

　　3、平衡。質(zhì)量和重心都必須平衡。注意，速度和加速度不能太快，否則會直接損壞超濾膜。開始離心超濾(將離心機(jī)預(yù)冷至4度)。膜片和旋轉(zhuǎn)軸的方向可根據(jù)說明進(jìn)行調(diào)整(在角離心機(jī)的情況下，膜片垂直于軸)。在實際使用中，一般速度低于說明書中的規(guī)定，可能會延長離心管的使用壽命。
 

　　4、濃縮至剩余的1ml時，[取50ul的家用Bradford溶液，加入10ul的流過液，看它是否變成藍(lán)色，并確定超濾管是否泄漏了蛋白質(zhì)。
 

　　如果管泄漏，則倒入上層，然后流回新管中以開始超濾。要準(zhǔn)確確定試管是否泄漏，請以5mg/mlBSA離心10min，然后將其通過，運(yùn)行蛋白凝膠或Bradford][粗測量]，繼續(xù)添加剩余的蛋白質(zhì)溶液以濃縮(在冰上操作以防止蛋白質(zhì)加熱)，直到所有濃縮溶液都加入為止。
 

　　在離心過程中，要注意是否發(fā)生蛋白質(zhì)沉淀并引起試管阻塞。如果發(fā)生沉淀，請確定沉淀的具體原因，蛋白質(zhì)濃度是否過高或緩沖液是否不合適;前者可以通過同時使用多個超濾管來解決，以降低濃度，后者可以改變不同的緩沖液，直到蛋白質(zhì)沉淀為止。
 

　　5、前面的步驟用于濃縮蛋白質(zhì)。如果要更換緩沖液，則在將總蛋白溶液濃縮至約1ml時，輕輕地添加新的緩沖液(通過0。22um超濾膜進(jìn)行超濾)，然后連續(xù)濃縮至約1ml，持續(xù)三倍，以最終濃度取決于所需的蛋白質(zhì)濃度，通常不大于500ul，也可以濃縮至小于200ul。根據(jù)每次至少10次的體積濃度，是三次的1000倍以上，基本上可以達(dá)到更換緩沖液的目的。
 

　　6、取出最終的蛋白質(zhì)濃縮物。在冰上操作。使用黃色的移液器吸頭(200ul)，沿邊緣輕輕插入移液器吸頭，然后輕輕吹動并混合蛋白質(zhì)溶液。
 

　　注意不要觸摸超濾膜。每次吸取濃縮溶液至200ul，直到吸完為止。不必抽出試管底部的最后濃縮溶液，否則太難了，可能會損壞超濾膜。最后，在不通過超濾膜的情況下，將MilliQ水添加到超濾管中，以防止濾膜失水和干燥。